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外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質內容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質、周質蛋白、黏附素、免疫調節(jié)化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細胞外間隔體，雙層磷脂，20至200納米大小，來自于革蘭氏陰性細菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產(chǎn)物，使之與環(huán)境或宿主細胞進行反應，并調解各種功能，包括促進病理形成，調節(jié)細菌互動，轉運各種信號分子（例如DNA、RNA、蛋白質、內毒素、毒力因子等），保護細菌生存、結合和侵入，引起毒性，產(chǎn)生抗生素抗性等。外膜囊泡的產(chǎn)量取決于細菌生長周期、營養(yǎng)條件、溫度、氧化應激狀態(tài)等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發(fā)中免疫調節(jié)潛力。通過差速離心和蛋白酶抑制混合劑，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質的免疫和生物學活性。
 
產(chǎn)品內容
 
HEPENGBIO保存液（Reagent A）        10毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent B）        5毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent C）        25微升
產(chǎn)品說明書        1份
 
保存方式
 
保存HEPENGBIO活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
 
用戶自備
 
50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
分光光度儀：用于測定細菌濃度
臺式離心機：用于樣品操作
超速離心機：用于樣品操作
恒溫搖床：用于培養(yǎng)細菌細胞
0.45微米濾膜：用于樣品操作
真空濃縮裝置：用于樣品操作
 
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將試劑盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent C）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO溶解液（Reagent B）到1.5毫升離心管，加入5微升HEPENGBIO活性液（Reagent C），充分混勻，置于冰槽里，標記為HEPENGBIO溶解工作液。然后進行下列操作。
 
1． 準備好1毫升過夜培養(yǎng)的新鮮細菌樣品
2． 移取500微升到50毫升細菌培養(yǎng)液（注意：用戶可以進行誘導培養(yǎng)，例如無鐵培養(yǎng)等）
3． 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為200RPM
4． 在分光光度儀上測OD600為1（1 OD＝1 X 10⁹細胞/毫升；總量為5 X 10¹⁰細胞） 
5． 轉移到預冷的50毫升錐形離心管
6． 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為5000g
7． 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管
8． 重復實驗步驟6和7一次
9． 使用0.45微米濾膜真空過濾一次
10． （選擇步驟）使用100kD蛋白臨界點濃縮處理
11． 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
12． 小心抽去上清液
13． 加入200微升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent A）
14． 或加入200微升預冷的含有HEPENGBIO溶解液（Reagent B）和HEPENGBIO活性液（Reagent C）的HEPENGBIO溶解工作液
15． 用槍頭上下抽吸，充分混勻
16． 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
17． 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用
18． 進行后續(xù)蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等
 
注意事項
 
1． 本產(chǎn)品為20次（50毫升菌液）操作
2． 所有操作須在4℃狀態(tài)下進行
3． 建議使用新鮮細菌接種，培養(yǎng)到指數(shù)生長階段為理想狀態(tài)
4． HEPENGBIO活性液（Reagent C）避免反復凍融
5． 本產(chǎn)品按照50毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應調整試劑用量
6． 根據(jù)菌種不同，50毫升（OD600＝1）菌液可獲得5至100微克外膜囊泡蛋白
7． 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?，嚴格避免反復凍?/div>