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組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時(shí)也是啟動和傳遞細(xì)胞凋亡信號的替代機(jī)制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患?；谌斯ず铣傻亩幕衔锏孜飠-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激發(fā)波長360nm；散發(fā)波長460nm），來定量測定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent D）和HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞
微型臺式離心機(jī)：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
96孔板或比色皿：用于樣品熒光測定的容器
熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品制備
1． 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長360nm，散發(fā)波長460nm，并置零
3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到2至5號管
5． 移取xx微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻
6． 小心移取xx微升1號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻
7． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻
8． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻
9． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3． 加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
7． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次
8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3． 加入10微升待測樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
7． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
五、 計(jì)算樣品實(shí)際活性
六、 酶標(biāo)儀測定
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
4． 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘
7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)
8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）
9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
10． 樣品實(shí)際活性計(jì)算：
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組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時(shí)也是啟動和傳遞細(xì)胞凋亡信號的替代機(jī)制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患?；谌斯ず铣傻亩幕衔锏孜飠-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激發(fā)波長360nm；散發(fā)波長460nm），來定量測定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent D） 微升
HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent D）和HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞
微型臺式離心機(jī)：用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育
96孔板或比色皿：用于樣品熒光測定的容器
熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品制備
1． 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞）
2． 小心加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HEPENGBIO30030.1）
16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里
2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長360nm，散發(fā)波長460nm，并置零
3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到2至5號管
5． 移取xx微升HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻
6． 小心移取xx微升1號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻
7． 小心移取xx微升2號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻
8． 小心移取xx微升3號管稀釋的HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻
9． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
| 管號 | HEPENGBIO緩沖液（Reagent C） | HEPENGBIO標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） | 標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度 |
| 1 | xx微升 | xx微摩爾/升 | |
| 2 | xx微升 | xx微升1號管 | xx微摩爾/升 |
| 3 | xx微升 | xx微升2號管 | xx微摩爾/升 |
| 4 | xx微升 | xx微升3號管 | xx微摩爾/升 |
| 5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3． 加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
7． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次
8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）
四、 樣品測定
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
3． 加入10微升待測樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
4． 上下傾倒數(shù)次，混勻
5． 在37℃溫度下孵育60分鐘
6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
7． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
五、 計(jì)算樣品實(shí)際活性
六、 酶標(biāo)儀測定
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent D）
4． 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在37℃溫度下孵育60分鐘
7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)
8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）
9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
10． 樣品實(shí)際活性計(jì)算：
