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腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型，又稱為E1E2 型，存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學分子，包括Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等，其中胃氫/鉀ATP酶，一種與胃酸分泌相關(guān)的質(zhì)子泵，屬于這一類型。V型，又稱為V1V0型，主要存在于真核細胞的液泡（vacuole）中。A型，又稱為A1A0型，存在于古生菌（archaea）中。E型，為細胞表面的酶。V型，又稱為V1V0型，也稱為氫V型ATP酶，主要存在于所有真核細胞的囊泡（vacuole或vesicle）中。F型ATP酶（F type ATPase），又稱為ATP合成酶（ATP synthase）、F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase）和線粒體呼吸鏈復(fù)合物V（complex V），主要在線粒體、葉綠體或細菌細胞膜上，進行氧化磷酸化或光合作用。細菌質(zhì)膜型F型ATP酶主要有兩個結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子轉(zhuǎn)運通道，由3個膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β3γδε蛋白構(gòu)成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。細菌F型ATP酶的主要功能通過ATP合成的逆向反應(yīng)，水解ATP，產(chǎn)生膜內(nèi)外質(zhì)子梯度變化，幫助細菌離子轉(zhuǎn)運和鞭毛運動（flagella motility）?；贏TP，在寡霉素參與下，受到F型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來定量分析F型 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
 
 
產(chǎn)品內(nèi)容
 
HEPENGBIO裂解液（Reagent A）    毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent B）  毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）  毫升
HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）       毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent E）    毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent F）  微升
HEPENGBIO專性液（Reagent G）    微升
產(chǎn)品說明書     1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D），避免光照，有效保證6月
 
用戶自備
 
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
恒溫搖床：用于細菌培養(yǎng)
培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育
比色皿：用于光度分析的容器
分光光度儀：用于光度分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準備
 
1． 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升
3． 置于冰槽里5分鐘
4． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
5． 小心抽去上清液
6． 加入xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent A），充分混勻
7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
8． 強力渦旋震蕩15秒
9． 置于冰槽里30分鐘，期間強力渦旋震蕩15秒三次
10． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為300g（或1000RPM，例如eppendorf 5415）
11． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
12． 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13． 小心去掉上清液 
14． 加入xx微升HEPENGBIO保存液（Reagent B），混勻
15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ ）
16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
二、測定準備
 
1． 準備好上述待測樣品，置于冰槽里 
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
四、 樣品總活性測定
 
1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
5． 加入100微升待測樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項10）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
五、 樣品非特異活性測定
 
實驗開始前，移取100微升待測樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細菌總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項10）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent G），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用

1． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
4． 放進30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘
5． 加入120微升上述預(yù)處理的待測樣品
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
 
六、 計算樣品活性
 
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
 
 
 
2）樣品特異活性
 
七、 酶標儀測定
 
1） 樣品總活性測定
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品總活性
2． 分別移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入xx微升HEPENGBIO陰性液（Reagent E）或待測樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細菌總蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動96孔板
9． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
10． 背景對照和樣品總活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
11． 活性計算
 
 
2） 樣品非特異活性測定
 
實驗開始前，移取25微升待測樣品（注意：20微克膜蛋白或50微克細菌總蛋白；樣品須溶解）到1.5毫升離心管，加入xx微升HEPENGBIO專性液（Reagent G），混勻后，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育15分鐘。然后置于冰槽里備用
 
1． 在96孔板上做好相應(yīng)標記：待測樣品
2． 移取xx微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 加入xx微升HEPENGBIO反應(yīng)液（Reagent D）
4． 加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在30℃溫度下孵育3分鐘
7． 加入30微升上述預(yù)處理的待測樣品
8． 輕輕搖動96孔板
9． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
10． 樣品非特異活性實際讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)1分鐘或5分鐘
11． 活性計算
3） 樣品特異活性計算