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線粒體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的最常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的方法基本上采用：第一，通過機械或化學方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。
產(chǎn)品內容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO強化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（HPBIO12028）或PBS緩沖溶液（HPBIO12033）：用于清理細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于細胞脫離
完全細胞培養(yǎng)液（HPBIO12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺式離心機：用于沉淀細胞
4℃超速離心機：用于分離細胞器成分
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
一、 動物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時）
2． （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
6． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
12． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
13． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
15． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
17． （選擇步驟）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
19． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
二、動物軟組織線粒體分離（化學處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時）
2． （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一個液氮凍存管
5． 即刻放入液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
11． 加入500微升預冷的HEPENGBIO強化液（Reagent D）
12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
15． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
16． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
17． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
19． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
21． （選擇步驟）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
23． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
三、動物細胞線粒體分離（細胞勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復實驗步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
16． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
17． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
18． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
20． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
21． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
23． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
25． （選擇步驟）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
27． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
四、動物細胞線粒體分離（化學處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復實驗步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
17． 加入500微升預冷的HEPENGBIO強化液（Reagent D）
18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
20． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
22． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
23． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
25． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
27． （選擇步驟）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
29． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
產(chǎn)品內容
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 100毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 40毫升
HEPENGBIO凈化液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO強化液（Reagent D） 5毫升
HEPENGBIO保存液（Reagent E） 100毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（HPBIO12028）或PBS緩沖溶液（HPBIO12033）：用于清理細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HPBIO12024）：用于細胞脫離
完全細胞培養(yǎng)液（HPBIO12052）：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗
1.5毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺式離心機：用于沉淀細胞
4℃超速離心機：用于分離細胞器成分
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
一、 動物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時）
2． （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
6． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
8． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
10． 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
11． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
12． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
13． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
14． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
15． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
16． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
17． （選擇步驟）小心抽去上清液
18． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
19． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
二、動物軟組織線粒體分離（化學處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 手術取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時）
2． （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入5毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4． 移入一個液氮凍存管
5． 即刻放入液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15毫升錐形離心管
8． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
9． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
10． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
11． 加入500微升預冷的HEPENGBIO強化液（Reagent D）
12． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
13． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
15． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
16． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
17． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
18． 小心抽去上清液，保留沉淀顆?！?strong>此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
19． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
20． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
21． （選擇步驟）小心抽去上清液
22． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
23． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
三、動物細胞線粒體分離（細胞勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復實驗步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
16． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
17． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項8）
18． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
20． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
21． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
22． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
23． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
24． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
25． （選擇步驟）小心抽去上清液
26． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
27． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
四、動物細胞線粒體分離（化學處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的HEPENGBIO凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO凈化液（Reagent C）和4毫升的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為HEPENGBIO裂解工作液，放進冰槽里備用。然后進行下列操作。
1． 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
3． 重復實驗步驟2一次
4． 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
7． 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
10． 小心抽去上清液
11． 加入10毫升預冷的HEPENGBIO清理液（Reagent A）
12． 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
13． 小心抽去上清液
14． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO裂解工作液
15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
17． 加入500微升預冷的HEPENGBIO強化液（Reagent D）
18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項9）
20． 加入5毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
21． 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
22． 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
23． 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA萃取，直接進入HEPENGBIO線粒體DNA萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
25． （選擇步驟）加入3毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent E）
26． （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
27． （選擇步驟）小心抽去上清液
28． 加入1毫升HEPENGBIO保存液（Reagent E），充分混勻
29． 即刻移入1.5毫升離心管，放進－70℃冰箱里
